Білок за методом К’єльдаля
Визначення загального азоту та білка за К’єльдалем
Метод К’єльдаля використовується в усьому світі як стандарт для аналізу вмісту азоту та білка в продуктах харчування, кормах, інгредієнтах кормів та напоях. Аналізи, які проводяться найчастіше, — це білок кукурудзи, ячменю, пшениці, насіння, а також білок у молоці, пиві, печиві, ковбасах, м’ясі та борошні.
У 1883 році датський вчений-хімік Йоганн К’єльдаль вперше опублікував опис винайденого ним методу кількісного визначення азоту в органічних речовинах. Метод мав безперечні переваги: був простий у виконанні, не вимагав багато часу, дорогих реактивів і обладнання для аналізу, показував точні та відтворювані результати. Згодом винайдений К’єльдалем метод став еталонним для аналізу вмісту білка. Етапи методу К’єльдаля з того часу не змінилися, проте суттєво змінився спосіб аналізу. Розвиток технологій дозволив вдосконалити та повністю автоматизувати процеси, що раніше виконувались вручну. Автоматичні прилади для визначення білка за К’єльдалем значно зменшують вплив людського фактора, забезпечують високий рівень точності результатів та безпеку роботи для операторів.
Основні етапи визначення масової частки білка за К’єльдалем
При визначенні азоту та білка за допомогою методу К’єльдаля виділяють три основні етапи:
Мета процедури розкладання — розірвати всі азотні зв’язки у зразку та перетворити весь органічно зв’язаний азот на іони амонію (NH 4 + ). В оригінальному методі К’єльдаля зразок змішують із сірчаною кислотою і кип’ятять при температурі від 350 до 380 °C протягом декількох годин. Швидкість мінералізації може бути значно збільшена додаванням солей калію або натрію та каталізаторів. Сульфат калію додається для підвищення температури кипіння сірчаної кислоти, а каталізатори прискорюють окислення. Використання каталізатора дозволяє підвищити температуру до 420 ºC, скорочуючи час розкладання приблизно до однієї години. Більшість лабораторій використовують попередньо приготовлені таблетки каталізатора К’єльдаля, щоб заощадити час та знизити ризик помилок. Як правило, таблетка містить 97–99 % солі та 1–3 % каталізатора або суміші каталізаторів (солі міді, сполуки селену, оксид титану та ін.), а також додаткові компоненти для запобігання спінюванню.
У процесі мінералізації утворюється розчин сульфату амонію, який необхідно перетворити на вільний аміак. Для цього використовується реакція з концентрованим лугом. Отриманий в результаті аміак відганяють за допомогою дистиляції з водяною парою до приймача з кислотою.
Кількісне визначення аміаку, що виділився, проводиться за допомогою колориметричного або потенціометричного титрування. Як правило, якщо в приймачі для аміаку знаходиться слабка кислота (борна), то титрування проводять сильною кислотою — соляною або сірчаною. Якщо аміак відганяють у сильну кислоту (HCl або H 2 SO 4 ), її надлишок титрують сильною основою (розчином NaOH).
Як визначити вміст білка за К’єльдалем: детально про метод
Для реалізації методу К’єльдаля в напівавтоматичному та автоматичному режимі використовуються блокові дигестори, які одночасно дозволяють проводити мінералізацію декількох десятків зразків, а також дистилятори з зовнішніми титраторами або повністю автоматизовані аналізатори з вбудованими системами титрування. Як відбувається визначення масової частки білка за К’єльдалем у таких приладах?
На стадії мінералізації наважка подрібненого зразка переноситься в пробірку, туди ж додається каталізатор. Потім у пробірку наливається концентрована сірчана кислота, і пробірки розміщуються в дигесторі (мінералізаторі). Зверху над пробірками встановлюють уловлювач пари, підключений до скрубера для нейтралізації парів сірчаної кислоти. Повністю закрита система не дозволяє ніяким шкідливим речовинам проникати у повітря. У дигесторі зразки спалюються за температури 420 о С. У процесі мінералізації під дією сірчаної кислоти під час нагрівання утворюється сульфат амонію. Після завершення мінералізації штатив з колбами охолоджується, при цьому скрубер працює ще деякий час, щоб остаточно зібрати всі леткі речовини, які утворюються в процесі мінералізації. Далі, у пробірку із зразком подається розчин лугу. При дії надлишку лугу із сульфату амонію виділяється аміак. В результаті дистиляції з водяною парою аміак надходить у приймальну колбу з розчином кислоти та індикаторами. Далі відбувається процес титрування розчину, що утворився, або розчином соляної/сірчаної кислоти, або лугом в залежності від методики.
Метод К’єльдаля дозволяє з високою точністю кількісно визначати азот та білок в органічних речовинах і широко застосовується у харчовій, сільськогосподарській промисловості, для аналізу ґрунтів, поверхневих та стічних вод, добрив.
Переваги аналізаторів азоту за К’єльдалем фірми OPSIS LiquidLINE
Одні з найкращих приладів для автоматичного визначення білка за методом К’єльдаля випускає OPSIS LiquidLINE — підрозділ відомої шведської корпорації OPSIS. Компанія розробила оригінальні технічні рішення для всіх стадій аналізу:
- мінералізатори (дигестори) різних моделей з ручними або автоматичними підйомниками, які дозволяють суттєво полегшити роботу та знизити ризики для операторів
- автосамплер, який автоматично передає проби після мінералізації в дистилятор, максимально збільшуючи пропускну спроможність та заощаджуючи час оператора
- автоматичні/напівавтоматичні дистилятори для перегонки з парою з можливістю підключення до різних зовнішніх титраторів
- повністю автоматизований аналізатор із вбудованою системою титрування.
Широкий вибір моделей приладів OPSIS LiquidLINE дозволяє підібрати оптимальний варіант під будь-які запити лабораторії.
Крім того, компанія-розробник надає унікальну можливість розширення функціональних можливостей аналізаторів KjeLROC. Використовуючи пакет оновлень, можна легко провести модернізацію приладів від базової конфігурації до системи з розширеними характеристиками. Це значно скорочує матеріальні витрати лабораторій, оскільки вартість оновлення значно менша, ніж придбання нового приладу з аналогічними можливостями. Таке рішення допомагає лабораторіям підвищити продуктивність та розширити діапазон аналітичної роботи з набагато меншими ресурсами.
OPSIS LiquidLINE вдалося привнести інновації в еталонний метод К’єльдаля, якому вже майже півтора століття. Розробники забезпечили повну автоматизацію процесу, досягли безпрецедентної точності аналізу завдяки унікальній функції прогнозуючого титрування. Системи OPSIS мають високу продуктивність, легко обмінюються даними з різними пристроями та інтегруються в LIMS, що забезпечує значне підвищення ефективності лабораторії.
10.МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКА
Білки – високомолекулярні біополімери, структурними елементами яких є амінокислоти. За своєю хімічною природою білки найбільш складні з відомих сполук нітрогену.
До складу білків входять такі елементи: карбон (50,5…54,5 %), гідроген (6,7…7,3), оксиген (21,5…23,5), нітроген (15…17 %), сульфур (0,3…2,5 %) й часто фосфор.
Молекулярна маса білків коливається в дуже широких межах: від 10000 до кількох сотен тисяч й більше. Фізико-хімічні властивості білків визначаються не лише їхньою структурою, але й якісним і кількісним складом амінокислот.
Найбільш відомим методом для кількісного визначення білків є метод Лоурі, однак в сучасній літературі описані ще декілька спектрофотометричних методів їх визначення. Об’єднує ці методи процес екстракції білків.
– 1..2 г дослідного матеріалу подрібнюють у ступці або гомогенізаторі;
– екстрагують тричі по 10 хв. 15 см 3 охолодженого ацетону;
– розчинник видаляють на роторному випарювачі або у вакуум-ексикаторі до одержання порошка;
– сухий порошок розчиняють у 15…20 см 3 0,1 М розчину фосфатного буфера (рН 7,0), що містить 0,1 М хлориду натру протягом 30 хв.;
– одержану суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом 20 хв.;
– відділену надосадову рідину розглядають як вихідний екстракт для подальшого визначення білка.
10.2 Визначення білка в рослинному матеріалі за методом О. Г. Варбурга та Е. Кристіана
Г рунтується на здатності ароматичних амінокислот (триптофану, тирозину й в меншій мірі фенілаланіну) поглинати УФ – промені з максимумом при 280 нм.
Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: ступка з товкачиком, мірні пробірки на 10 см 3 , мірні циліндри на 10…100 см 3 ; роторний випаровувач або вакуум-ексикатор, центрифужні пробірки, центрифуга, рН-метр.
Реактиви : ацетон, KH 2 PO 4 або K 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 або NaH 2 PO 4 для приготування фосфатного буфера, хлорид натру.
– надосадову рідину, одержану вище описаним способом (п.10.1), поміщають в кювету спектрофотометра;
– за нульовий розчин служить 0,1 м фосфатний буфер (рН 7), що містить 0,1 М хлорид натру;
– оптичну густину вимірюють при довжині хвилі 260 й 280 нм: оскільки білки відрізняються за вмістом ароматичних амінокислот, їх поглинання в УФ ділянці спектра може значно розрізнятися. Умовно вважають, що при концентрації «середньої» кількості білка в розчині, яка становить 1 мг/см 3 , величина оптичної густини при 280 нм дорівнює 1,0 (при товщині шару рідини 1 см).
Визначенню білків цим методом заважає наявність нуклеїнових кислот й нуклеотидів. Вимірюючи оптичну густину розчинів при 260 та 280 нм для врахування поглинання сполук нуклеотидної природи, вміст білка обчислюють за допомогою номограми (рис. 32). При цьому експериментально одержані величини оптичної густини при 260 та 280 нм знаходять у відповідних стовпчиках номограми й з’єднують їх прямою лінією: місце перетину цієї прямої зі шкалою, на якій представлена концентрація білка, визначає його вміст у дослідному розчині.
Вміст білка в досліджуваній біомасі можна знайти також за формулою Калькара на основі даних визначення оптичної густини при 280 та 260 нм:
D 280 , D 260 – оптична густина за відповідних довжин хвиль.
Обчислюють відношення D 280 / D 260 за допомогою табл. 10.1 або графіка, побудованого за наведеними у таблиці даними. Знаходять множник f , що відповідає D 280 / D 260 . Тоді вміст білка визначають за формулою:
Множники f для обчислення концентрації білка
Вміст нуклеїнової кислоти*, %
Вміст нуклеїнової кислоти*, %
* Вміст нуклеїнових кислот відносно загальної концентрації білка (білок+НК)
10.3 Спектрофотометричний метод визначення білка
Полягає у зв’язуванні з білками одного з кислих барвників кумассі синього, який виробляють у двох модифікаціях: R -250 і G -250. При зв’язуванні з білками спектр поглинання барвника змінюється: інтенсивність
забарвлення залежить від концентрації білка в пробі, а в діапазоні 1 – 10 мкг/см 3 ці зміни дають лінійну залежність.
Багато з досліджуваних сполук (фосфат, цитрат, пірофосфат, ацетат, HEPES , MOPS , MES , BES , PIPES , трис, форміат, ЕДТА, гліцин, тирозин, а також аденозин, АТФ, тимідин, ДНК, РНК, поліаденілова кислота) не впливають на розвиток забарвлення. Наявність в середовищі інкубації амфолінів викликає значне збільшення оптичної густини. Оскільки білки розрізняються за своєю здатністю зв’язувати барвники, бажано будувати калібрувальні графіки з використанням того білка, концентрацію якого в подальшому прагнуть визначити.
Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: гомогенізатор, мірні колби, піпетки, мірні целіндри, спектрофотометр, пробірки, секундомір.
Реактиви стандартний розчин білка, що містить його 0,05 мг/см 3 , етанол (95 %), фосфорна кислота (85 %),
Розчин барвника кумассі синього, який виготовлений за одним із двох варіантів:
– Реактив А. 100 мг кумассі яскраво-синього G -250 гомогенізують в скляному гомогенізаторі в 50 см3 95 %-вого етанолу; одержаний розчин змішують з 100 см 3 85 %-вої фосфорної кислоти; суміш доводять до 1000 см 3 дистильованою водою, фільтрують, зберігають при кімнатній температурі 2 тижня.
– Реактив Б. 60 мг кумассі яскраво-синього G -250 розчиняють у 1000 см 3 3 %-вої надхлоридної кислоти й фільтрують для усунення залишків нерозчиненого барвника. Величина поглинання світла (оптична густина) розчину при 465 нм повинна бути між 1,3 й 1,5. Цей розчин зберігається необмежено довго.
Виготовлений реактив називають розчином Бредфорда, який має максимум поглинання 595 нм, тобто у видимій частині спектра.
– при визначенні білка 1,5 см 3 дослідного розчину, що містить від 10 до 50 мкг білка, змішують з 1,5 см 3 розчину Бредфорда;
– через 20…30 хв. вимірюють поглинання світла при 595 нм, використовуючи як нульовий (контрольний) розчин пробу, що не містить білків;
– концентрацію білка в пробі визначають за допомогою калібрувального графіка, який будують на основі ряду точно виготовлених білкових розчинів;
– для виготовлення останніх використовують кристалічний препарат чистого білка;
Якщо мають справу з концентрованими білковими розчинами (˃5 мг/см 3 ), зручніше брати 1,5 см3 води або розбавленого розчину хлористого натру, додати дослідний розчин мікролітровим шприцем, розчин ретельно перемішати і потім до нього додати барвник. Концентрований білковий розчин при контакті з барвником утворює осад. Реактив А дає більш високе поглинання, ніж реактив Б, але він менш стійкий при зберіганні.
Побудова калібрувального графіка
Використовують кристалічний препарат чистого дослідного білка, білок яйця або альбумін сироватки.
– 30 мг білка розчиняють в 100 см 3 води (розчинність 100 %);
– З цього розчину відбирають серію пробірок відповідно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 см 3 розчину білка;
– в кожну пробірку додають по 1,5 см 3 дистильованої води;
– розчини містять відповідно від 10 до 70 мкг білка;
– в кожну пробірку додають по 1,5 см 3 розчину Бредфорда;
– через 5…10 хв. вимірюють оптичну густину при 595 нм, використовуючи як контроль пробу, що не містить білок;
В описаній методиці D 595 лінійно залежить від кількості білка в інтервалі від 10 до 50 мкг.
10.4 Визначення білка за методом О. Лоурі
Визначення білка за Лоурі грунтується на його реакціїї зреактивом Фоліна, яка виявляє в білках тирозин та триптофан. Забарвлений білковий комплекс одержують в два етапи: 1) реакцією міді з білком в лужному середовищі; 2) відновлення фосфомолібденово-фосфовольфрамового реагента білком, що оброблений міддю.
Реакція білка з міддю закінчується за 5…10 хв. за кімнатної температури. Максимальне забарвлення спостерігається при рН 10…10,5. При більш високому рН забарвлення розвивається швидше, однак швидше й зникає. В автоматизованих системах спектрофотометрів, де час реакції точно контролюється, краще використовувати більш швидкий розвиток реакції при рН 11. Для цього треба підвищити концентрацію Na ОН в реактиві В до 30…40%.
При роботі на СФ ручного режиму доцільно стабілізувати рН на рівні 10-ти, а при порівняльних дослідах точно витримувати час вимірювання та його умови. При додаванні реактиву Фоліна в суміш із затримкою на декілька секунд спостерігається слабке забарвлення.
Недоліком цього методу є те, що інтенсивність забарвлення різна у різних білків і не пропорційна концентрації білка в розчині.
Такі речовини як фенол, ПАСК (парааміносаліцилат натру), ТРИС (гідроксиметиламінометан), ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) та деякі інші заважають визначенню білка за Лоурі. Фенол, ТРИС та ПАСК збільшують інтенсивність забарвлення, ЕДТА, навпаки, знижує його. Тому перед визначенням білка за Лоурі з розчину треба вилучити ці домішки діалізом, гельфільтрацією, додаванням надлишку іонів кальцію (якщо є ЕДТА). Ці домішки також треба враховувати при побудові калібрувального графіка, якщо в ньому виникає потреба при використанні фотоелектроколоримертів.
Застосування методу при роботі зі забарвленими тканинами потребує додаткової обробки матеріалу органічними розчинниками для вилучення пігментів.
Обробка листків, хлоропластів органічними розчинниками необхідна для вилучення пігментів та фенольних сполук, які забарвлюються реактивом Фоліна. Оскільки більша частина пігментів та ліпідів листків знаходиться в комплексі з білками, обробка органічними розчинниками може привести до втрати частини (іноді значної) білка ліпопротеїдної природи. Щоб запобігти цьому слід користуватися дуже охолодженими (до – 10°С) розчинниками. Крім того, необхідно запобігати підкисленню органічного розчинника тому що значно збільшується розчинність й ліпопротеїдів.
Гліцин (0,5) знижує на 50 % забарвлення, обумовлене білком. В зв’язку з цим при визначенні білка, що знаходиться в трис-гліциновому буфері, спочатку усувають гліцин шляхом осадження всього білка 10 % розчином трихлороцтової кислоти, центрифугують при 1000 об/хв., потім буфер зливають, а осад розчиняють в 0,5 М Na ОН. Цей лужний розчин й беруть для визначення білка.
Фосфатні буфери в концентрації вище 0,1 М викликають появу осаду. Відомі також речовини (нижче вказана кінцева концентрація, %), що не мали впливу на інтенсивність забарвлення, а саме: сечовина 0,5, гуанідин 0,5, натрій вольфрамат 0,5, натрій сульфат 1,0, натрій нітрат 1,0, цинк сульфат 0,1, амоній сульфат 0,15, хлоридна кислота нейтралізована 0,5, трихлороцтова кислота нейтралізована 0,5, етиловий спирт 5,0, етер 5,0, ацетон 0,5, барій гідроксид 0,5.
Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: піпетки на 1…2 см 3 градуйовані, мірні циліндри на 100 см 3 , мірні колби на 1000 см 3 , круглодонна колба на 1500…2000 см 3 , пробірки на 3…10 см 3 , посуд для реактивів, центрифуга звичайна, центрифуга з охолодженням, холодильник Лібіха, холодильник кульковий, водяна баня.
Реактиви: ацетон, етиловий етер сульфатної кислоти (етилсульфат), трихлороцтова кислота (2% та 5 %), ортофосфорна кислота, хлоридна кислота, їдкий натр (0,5 н), натрій або калій гідротартрат, купрум сульфат, натрій вольфрамат, натрій молібдат, літій сульфат, бромна вода, кристалічний білок.
Реактив А (2 % розчин Na 2 CO 3 у 0,1 н NaOH : 20 г Na 2 CO 3 в 1000 см 3 0,1 н розчину NaOH . Розчин готують в день проведення аналізу.
Реактив В (0,5 % розчин CuSO 4 •5 H 2 O в 1 % розчині натрій або калій гідротартрату ) : 10 г Na 2 C 4 Н 4 О 6 (К 2 C 4 Н 4 О 6 ) розчиняють в 300 см 3 дистильованої води. В цей розчин додають 5 г CuSO 4 •5 H 2 O , після розчинення реактиву обєм суміші доводять до 1000 см 3 дистильованою водою. Розчин виготовляють в день проведення аналізу.
Реактив С : перед визначенням готують суміш 50 см 3 реактиву А змішують з 1 см 3 реактиву В.
Реактив Фоліна – Чокальтеу : в круглодонну колбу на 1500…2000 см 3 вносять 100 г натрій вольфрамату і 25 г натрій молібдату, розчиняють їх в 700 см 3 дистильованої води.
До розчину додають 50 см 3 85 %-ї фосфорної кислоти і 100 см 3 концентрованої хлоридної кислоти. Колбу з’єднують із оберненим холодильником і суміш кип’ятять при слабкому нагріванні на сітці 10 годин. Після закінчення кип’ятіння в колбу додають 150 г літій сульфату, 5 см 3 води та 5 крапель бромної води. Суміш кип’ятять без холодильника 15 хв. у витяжній шафі. Потім розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять об’єм водою до 1000 см3 , фільтрують і зберігають в темній склянці з притертим шліфом. В одержаному реактиві визначають кислотність. Для цього реактив розводять в 10 разів і титрують 0,1 н NaOH по фенолфталеїну.
Реактив Е готують з реактиву Фоліна розведенням останнього дистильованою водою до 1 н розчину (за кислотою). Наприклад, при титруванні реактиву Фоліна його кислотність становила 2,3 н, то для виготовлення реактиву Е необхідно брати 10 см 3 реактиву Фоліна і 13 см 3 дистильованої води. Реактив Е зберігається тривалий час.
– 100 см 3 ліофільно висушеного або фіксованого іншим методом матеріалу заливають холодним ацетоном, суспензують;
– центрифугують з охолодженням 5 хв. при 3000 об/хв. Цю операцію повторюють 2…3 рази до повного виділення пігментів;
– осад промивають етилсульфатом і знову ацетоном,
– осад без пігментів настоюють при охолодженні 30 хв з 5 %-вою трихлороцетовою кислотою;
– центрифугують, потім осад промивають 2 % -вою трихлороцтовою кислотою;
– промитий осад розчиняють в 2 см 3 0,5 н NaOH протягом 5 хв. на киплячій бані;
– центрифугують, осад вдруге промивають 5 см 3 NaOH ,
– в реакційну суміш беруть 0,1 см 3 розчину (оптичну густину дослідного матеріалу визначають експериментально).
– до 0,1 см 3 досліджуваного розчину додають 0,9 см 3 дистильованої води, 5 см 3 реактиву С,
– суміш ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв.;
– в кожну пробірку доливають 0,5 см 3 реактиву Е і проби залишають при кімнатній температурі на 30 хв. для розвитку забарвлення;
– в присутності білка жовте забарвлення поступово змінюється на синє;
– інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі при 750 нм;
– концентрацію білка в пробі визначають за допомогою калібрувального графіка.
Побудова калібрувального графіка
– використовують кристалічний препарат чистого білка, найчастіше яєчний альбумін;
– 30 мг білка розчиняють в 100 см 3 води;
– з цього розчину відбирають в серію пробірок відповідно по 0,1, 0,3, 0,5, 0,7 та 0,9 см 3 розчину білка;
– додають 5 см 3 реактиву С, витримують 10 хв, потім 0,5 см 3 реактиву Е;
– залишають розчин на 30 хв.;
– вимірюють його оптичну густину на спектрофотометрі при 750 нм.
концентрацію білка Х (мг/г) в дослідному розчині обчислюють за формулою:
де А – кількість білка в мг в 1 см 3 дослідного розчину (визначають за калібрувальним графіком);
V – об’єм, в якому розчинена наважка, см 3 ;
V 1 – кількість вихідного розчину, що взятий для визначення, см 3 ;
За кінцевий результат випробувань приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допустим а абсолютна розбіжність між якими не повинн а перевищувати 0,10%.
10.5 Визначення вмісту загального нітрогену
Визначення вмісту нітрогену ґрунтується на руйнуванні органічної речовини сульфатною кислотою у присутності каталізатора. При цьому вивільняється нітроген у формі амоніаку, який сполучається із сульфатною кислотою й утворює амоній сульфатний. За додавання до останнього лугу виділяється амоніак, який відганяють і вловлюють титрованим розчином сульфатної кислоти, а надлишок кислоти відтитровують лугом.
За кількістю амоніаку визначають вміст нітрогену. Отриману кількість нітрогену помножують на відповідний коефіцієнт, обчислюють вміст білка (сирого протеїну).
У крохмалистих і цукристих видах рослин із високим в містом води (картопля, капуста, цибуля, часник, кукурудза цукрова, горох моз к овий, горох лущильний) вміст нітрогену рекомендовано визначати в сирій речовині.
Коефіцієнт перерахунку нітрогену на сирий білок для овочевих – 6,25.
Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, посуд, реактиви і матеріали: бюкси металеві, ложечка металева вузька; колби конічні круглодонні з корком К’єльдаля на 100…550, колби прийомні (конічні чи плоскодонні) на 250…300 см 3 ; краплевловлювач (насадки К’єльдаля); холодильники кулькові; бюретки на 50 см 3 ; мірні колби на 1000 см 3 ; хімічні стакани на 500…1000 см 3 ; мірні циліндри на 10, 25 і 50 см 3 ; мензурки або мірні циліндри на 100 см 3 ; лійки звичайні; фарфорова ступка, плитка електична, терези лабораторні, горілка газова лабораторна, сітка азбестова, фольга алюмінієва, папір фільтрувальний лабораторний, папір лакмусовий червоний.
Реактиви: сульфатна кислота концентрована (густина 1,84 г/см 3 ), яка не містить амоніаку; бурштинова кислота, хімічно чиста; селен метал евий; купрум сульфат ; к алій сульфат; н атронне вапно гранульоване .
М етиловий червоний : 0,02 г індикатора розчиняють у 100 см 3 60 % (краще 96 %) етилового спирту.
Комбінований індикатор : змішують 100 см 3 розчину метилового червоного (1 г метилового червоного розчиняють у 750 см 3 96 % етилового спирту) і 50 см 3 розчину метиленового синього (1 г метиленового синього розчиняють у 800 см 3 96 % спирту). В кислому розчині індикатор дає червоно-фіолетове забарвлення, в лужному – зелене. В перехідній стадії, за рН 5,5 індикатор безбарвний. Його зберігають у темній склянці. Комбінованим індикатором зручно користуватися у випадку титрування за електричного освітлення.
Р озчин сульфатної кислоти ( 0,1 н): 2,8 см 3 хімічно чистої концентрованої кислоти (густиною 1,84 г/см 3 ) беруть автоматичною піпеткою чи мірним циліндром, вливають у колбу місткістю 1 000 см 3 з налитою до половини дистильованою водою й доводять до мітки водою. Для приготування кількох літрів розчину с ульфатної кислоти об’єм води відповідно збільшують. Розчин ретельно перемішують. Приготований розчин не буде точно 0,1 Н, але його титр визначати не потрібно.
Р озчин їдкого натр у ( 0,1 н): з а масових аналізів готують 10 … 12 л розчину. Як правило, їдкий натр вкривається шаром карбонату натру, який утворюється від взаємодії з вуглекислотою повітря. Тому, готуючи розчин, беруть дещо більшу наважку, або за розрахунком (наприклад, замість 4 г на 1 000 см 3 беруть 4,5 г) і перед розчиненням швидко споліскують водою. Спочатку готують насичений розчин лугу, для цього обмиту водою наважку розчиняють у рівній за масою кількості води. Після охолодження розчин залишають на 3 … 4 тижні у склянці чи циліндрі, закритих гумовими корками, домішки карбонату натру при цьому випадають в осад. Розчин лугу обережно зливають, щоб його не збовтати, і розбавляють потрібною кількістю води для отримання 0,1 н розчину. Розчин їдкого натр у змінює свій титр за поглинання вугільної кислоти з повітря, тому його ізолюють, ставлячи в бутель, сполучений із зовнішнім повітрям лише через трубку з натронним гранульованим вапном.
Розчинами лугу й кислоти можна користуватися тривалий час, але при цьому слід кожні два тижні перевіряти титр 0,1 н їдкого натр у і встановлювати знову співвідношення між розчинами кислоти і лугу.
Визначення титру 0,1 н розчину їдкого натр у : для встановлення титру краще користуватися бурштиновою кислотою С 2 Н 4 (СООН) 2 , яка не містить кристалізаційної води. Її легко отримати в чистому вигляді методом перекристалізації та сушіння за кімнатної температури. За наявності хімічно чистої бурштинової кислоти перекристалізацію можна не робити. Розчин бурштинової кислоти титрують за кип’ятіння у присутності індикатора фенолфталеїну, тому що ця кислота слабка.
Зважують на аналітичних терезах у скляні бюкси 3…4 наважки бурштинової кислоти по 0,1…0,2 г. Сушать наважки до постійної маси за температури 100°С, зважують бюкси з точністю до 0,01 г, а потім кожну з них висипають із бюкса в колбу для титрування й розчиняють у 20…25 см 3 дистильованої води, а бюкси зі слідами бурштинової кислоти знову зважують. Різниця між результатами двох зважувань показує масу наважки. Приготовані розчини кип’ятять, додають 3…4 краплі фенолфталеїну й титрують розчином їдкого натр у до появи не зникаючого протягом 50 … 60 с, рожевого забарвлення.
Приклад розрахунку . На титрування 0,1179 г бурштинової кислоти витрачено 21,35 см 3 0,1 н розчину їдкого натр у . З реакції взаємодії кислоти й лугу
НООС – (СН 2 ) 2 – СООН + 2 NaOH = NaOOC – ( CH 2 ) 2 – COONa + 2 H 2 O
випливає, що одна молекула бурштинової кислоти еквівалентна двом молекулам їдкого натру. Тоді 118,09 : 80,01 = 0,1179 : 21,35, звідси титр 0,1 н розчину їдкого натр у дорівнює:
Із 3–4 визначень беруть середнє.
Обчислення 0,1 н розчину їдкого натру за нітрогеном : 1 см 3 точно 0,1 н розчину сульфатної кислоти відповідає 0,0014 нітрогену й еквівалентний 1 см 3 точно 0,1 н розчину їдкого натру.
Звідси 1 см 3 0,1 н розчину їдкого натр у еквівалентний 0,0014 г (1,4 мг) нітрогену. Знаходимо, якій кількості нітрогену відповідає 1 см 3 нашого 0,1 н розчину їдкого натр у: 0,004 : 0,0014 = 0,003741 : Х , звідси :
Це й буде титром розчину 0,1 н їдкого натру, виражений за нітрогеном.
Розчин їдкого натру густиною 1,26–1,28 г/см 3 . 1 кг їдкого натру розчиняють у 3000 см 3 дистильованої води, фільтрують крізь кілька шарів марлі та крізь скляну вату, охолоджують до кімнатної температури й перевіряють питому масу аерометром. За розчинення лугу відбувається сильне нагрівання, тому його спочатку розчиняють у фарфоровій ступці, безперервно обережно помішуючи товстою скляною паличкою.
Реактив Несслера . 17 г меркурій (ІІ) хлориду розчиняють у 300 см 3 дистильованої води у хімічному стакані місткістю близько 0,5 см 3 ; 35 г калій йодиду розчиняють у 100 см 3 дистильованої води й переливають у склянку місткістю близько 1500 см 3 з міткою 1 000 см 3 . Далі повільно вливають перший розчин до другого, доки утворений при цьому червоний осад меркурій йодиду перестане розчинятися. Переливаючи 20 %-ий розчин їдкого натр у , об’єм отриманого реактиву доводять до одного л и тра, додають розчин меркурій (ІІ) хлориду у склянку, доки знову з’явиться незникаючий осад.
Забарвлення відстояної рідини у склянці має бути світло-жовтим. Якщо вона безбарвна, додають ще розчин меркурій (ІІ) хлориду . Приготовлений реактив обережно зливають у склянку з темного скла і зберігають у темному місці. Чутливість реактиву до іону амонію після тривалого зберігання знижується.
Каталізатор . Каталізатором є суміш із калій сульфату, купрум сульфату та селену металічного, взятих у пропорції 100:10:2, яка підвищує температуру кипіння сульфатної кислоти і прискорює спалювання органічної речовини. Спочатку у ступці розтирають лише селен, потім туди ж додають купрум сульфат, потім калій сульфат, перемішують і просіюють крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм. Не просіяну частину знову розтирають.
Вода для титрованого розчину лугу . Дистильована вода після її отримання містить велику кількість карбонатної кислоти, яка дуже повільно вивільняється. Для її швидкого вивільнення дистильовану воду кип’ятять у колбі протягом півгодини й охолоджують з щільно закри тим корком, який має трубку з натронним вапном. Цей спосіб вивільнення карбонатної кислоти загальноприйнятий, але за масових аналізів краще застосовувати інший, спрощений спосіб, пропускаючи через дистильовану воду впродовж 10 год ин потік повітря, очищеного кислотою та водою. У дистильованій воді, яка перебуває в рівновазі з повітрям, міститься така незначна кількість карбонатної кислоти, що нею можна знехтувати.
Прилад для пропускання струменя повітря збирають у такий спосіб. Бутель із водою закривають гумовим корком, крізь який пропущені довга (до дна) й коротка (яка сягає рівня води в бутлі) скляні трубки. Коротку трубку через запобіжну склянку приєднують до водоструменевого насосу, за допомогою якого повітря пропускають крізь воду. Повітря очищують, пропускаючи його попередньо через три промивні склянки: в першу наливають концентровану сульфатну кислоту, друга (пуста) є запобіжною, а у третій знаходиться дистильована вода. Останню склянку з’єднують із скляною трубкою, яка пропущена через корок бутеля до дна.
– c ередні проби овочевих, узяті з подрібненої маси, подрібнюють у гомогенізаторі або розтирають у ступці до такого стану, щоб увесь матеріал проходив крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм;
– зважують на технічних терезах у фарфорову чашку або бюкс з добре подрібненої проби по дві наважки від 3 до 10 г (залежно від умісту нітрогену в речовині);
– д ля капусти та картоплі можна брати 7 г ;
– для страв з продуктів тваринного походження і з бобових – 0,5 – 1,0 г;
– для страв з продуктів рослинного походження, за винятком страв з бобових, – більше 1 г;
– для страв продуктів тваринного та рослинного походження – 1 г,
– наважки страв рідкої консистенції зважують на фользі у вигляді човника;
– н аважку разом з фільтрувальної папером або фольгою , без втрат переносять у колбу К’єльдаля місткістю 100 см 3 для спалювання, змиваючи залишки частинок невеликою кількістю води ;
– для прискорення процесу спалювання і зменшення піноутворення рідини воду з колби попередньо випаровують, слідкуючи за тим, щоб речовина не обвуглилась (чим більше буде видалено води, тим менше буде утворюватися піна при спалюванні);
– до колби приливають концентровану сульфатну кислоту з розрахунку 12 см 3 на 1 г сухої речовини ;
– колбу К’єльдаля встановлюють на електричну плитку в похилому положенні під кутом близько 40 ° в витяжній шафі за допомогою штатива;
– д ля попередження піноутворення до колби додають 1 см 3 етилового спирту ;
– спалювання триває кілька годин, спочатку за слабкого нагрівання;
– к оли виділення білих парів припиняється, додають 2 г каталізатора та підсилюють нагрівання колби;
– щоб уникнути викидання рідини колбу К’єльдаля закривають скляною грушоподібною конусоподібною пробкою,
– потім обережно проводять спалювання протягом 4-8 годин, в залежності від складу досліджуваного матеріалу;
– за піноутворення колбу знімають з вогню і злегка струшують для руйнування піни;
– для змивання часток органічної речовини, які прилипають до стінок колби, її час від часу повертають, перемішуючи вміст;
– спалювання закінчують після появи чистого зеленувато-блакитного забарвлення рідини, яке зникає після охолодження;
– якщо на горловині колби й на пробці залишився наліт органічної речовини, його змивають невеликою кількістю дистильованої води в охолоджену колбу і знову спалюють до появи вказаного вище забарвлення;
– збирають установку для відгону амоніаку згідно з рисунком 33: плоскодонну колбу за допомогою гумової пробки з’єднують через краплеуловлювач з кінцем кулькового холодильника; холодильник
закріплюють на штативі і підводять до нього дистильовану воду; у цю ж пробку вставляють скляну сполучну трубку, на яку надягають гумову трубку з затискачем; до нижнього кінця холодильника, за допомогою гумової трубки, приєднують скляний кінцевик. Кінцевик закупорюють у конічну колбу (приймач) місткістю 250 см 3 , в яку попередньо доливають 40 см 3 розчину сульфатної кислоти молярної концентрацією 0,05 моль/дм 3 (0,1 н), для уловлювання амоніаку. Кінцевик занурюють на 1,5…2 см у розчин сульфатної кислоти, перевіряють герметичність з’єднань. Критерієм підтвердження герметичності є відсутність утворення білих кристалів амоній сульфату (при негерметичності амоніак взаємодіє з сульфатною кислотою з утворенням білих кристалів);
– вміст колби К’єльдаля (мінералізат) охолоджують до температури 40 ° С,
– в колбу обережно доливають по стінці близько 50 см 3 дистильованої води;
– рідину перемішують круговими рухами і переливають в плоскодонну колбу місткістю 500-1000 см 3 ;
– колбу К’єльдаля кілька разів обполіскують дистильованою водою, яку зливають в ту ж плоскодонну колбу;
– всього на перенесення наважки використовують 150…200 см 3 дистильованої води;
– у плоскодонну колбу, в яку поміщений розчин мінералізату, занурюють червоний лакмусовий папір;
– вливають розчин їдкого натру з масовою часткою 33% за допомогою лійки, з розрахунку 40 см 3 на кожні 10 см 3 сульфатної кислоти, взятої для спалювання наважки (додають розчин їдкого натру до синього кольору за лакмусом);
– далі установку для відгону амоніаку щільно приєднують до колби і ще раз перевіряють на герметичність;
– вміст плоскодонної колби перемішують круговими рухами;
– плоскодонну колбу закріплюють на штативі, поміщають під неї електричну плитку або газову горілку з азбестовою сіткою;
– вмикають воду і виконують відгін амоніаку при постійному кипінні вмісту колби;
– закінчення виділення амоніаку встановлюють по зникненню лужної реакції відігнаної рідини (відгону) за червоним лакмусовим папером;
– після відгону скляний кінцевик промивають дистильованою водою для того, щоб змити сульфатну кислоту;
– конічну колбу (приймач) знімають і вміст титрують розчином їдкого натру молярною концентрацією 0,1 моль/дм 3 (0,1 н) у присутності 3…5 крапель розчину фенолфталеїну або змішаного індикатора. Титрування ведуть до переходу безбарвного розчину в слабо-рожевий (при використанні фенолфталеїну) або з фіолетового в зелений (при використанні змішаного індикатора);
– паралельно проводять контрольний дослід: у мірну склянку місткістю 100 см 3 обережно наливають 40 см 3 сульфатної кислоти молярною концентрацією 0,05 моль/дм 3 і титрують розчином їдкого натру молярною концентрацією 0,1 моль/дм 3
Масову частку нітрогену Х ,%, розраховують за формулою:
де К б – коефіцієнт перерахунку масової частки нітрогену, розрахованої за формулою ( 10.4 ) на масову частку білка, який для овочевих дорівнює 6,25, в стравах з використанням харчових продуктів тваринного походження – 6,25, в стравах з використанням продуктів рослинного походження – 5,7 … 6, в залежності від виду рослинної сировини (в зернових – 5,7; в бобових – 6).
За необхідності представлення результатів вимірювань білка в грамах на порцію страви (вироб у ) у чис лівнику формули (1 0.4 ) множник 100 замінюють на значення маси аналізованої порції страви (вироб у ) в грамах.
У приймальн у колбу взято 30 см 3 точно 0,05 моль/дм 3 розчину сульфатної кислоти. На титрування надлишку сульфатної кислоти пішло 21,56 см 3 точно 0,1 моль/дм 3 розчину їдкого натр у . Нав ажка другої страви, взята для аналізу, становить 0,5 г. Маса страви – 250 г.
Кількість нітрогену в страві, г:
Кількість білка в страві, яка виготовлен а з використанням продуктів тваринного походження: 6,75•6,25 = 42,18 г.